Suplemento 2.20: Absorbancia y Fluorescencia de los Aceites (2/2)
Método de Medición de la Absorbancia
La absorbancia de los aceites es un parámetro auxiliar importante en muchas investigaciones fluorométricas. La absorbancia de muchos productos químicos se puede determinar fácilmente con un espectrofotómetro convencional utilizando cubetas de muestra estándar de 1 cm x 1 cm. Sin embargo, los petróleos crudos tienen una absorbancia comparativamente mucho más alta y hacen necesario el uso de cubetas con una longitud de trayectoria óptica de 1 a 10 μm.
Alternativamente, la muestra se puede diluir en un disolvente orgánico hasta un nivel de concentración que garantice la transmisión de la luz a distancias de unos pocos milímetros. Los experimentos han demostrado que el ciclohexano es el más adecuado para este propósito: otros tipos de solventes no son adecuados para disolver todos los compuestos de las muestras de petróleo crudo. De esta manera, se evita el uso de configuraciones ópticas para el análisis de líquidos altamente absorbentes, que generalmente no están disponibles, y se pueden realizar mediciones de absorción con cubetas estándar y fotómetros de laboratorio.
Para cubrir todo el rango de longitudes de onda de la teledetección óptica, se realizaron mediciones de absorbancia a longitudes de onda entre 250 y 700 nm con una resolución de 1 nm. La absorbancia del disolvente utilizado para diluir la muestra se discrimina mediante una medición de doble haz, con el disolvente en la cubeta de referencia.
Un ejemplo: Medición con el Espectrofotómetro Kontron UVIKON 810
Los datos de absorbancia medidos con este instrumento se obtuvieron utilizando cubetas de cuarzo con una longitud de trayectoria óptica de 1 cm. Se utiliza una lámpara de deuterio entre 250 y 340 nm, una lámpara halógena de tungsteno en longitudes de onda más altas. La salida de datos se da en Unidades de Absorbancia (ABS) que corresponde a:
donde es la intensidad de la luz incidente e es la intensidad transmitida a través de la cubeta de muestra. El rango dinámico es de -0.3 a 4 ABS, con una precisión especificada de 0.002 ABS a 1.0 ABS.
Los datos ABS se convirtieron en coeficientes de absorción a en la Ley de Absorción de Lambert
con la longitud de cubeta d, consulta la pregunta ¿Cuál es el espesor de las películas de aceite? en el suplemento 2.19, página 3. Al invertir la ecuación se obtiene:
Con la transformación
sigue:
Las muestras de aceite se diluyeron con ciclohexano hasta una concentración que arroja datos dentro del rango dinámico del instrumento. Para evitar posibles errores por interacciones con el disolvente, se realizan una serie de diluciones con cada muestra. A partir de estos datos, se calcula un promedio de todo el rango lineal, y los coeficientes de absorción a se derivan de este promedio.
Método de Medición de Fluorescencia
Los datos incluidos en el catálogo se midieron con espectrofluorómetros convencionales, que son equipos estándar en la mayoría de los laboratorios químicos. Estos instrumentos cumplen los requisitos de proporcionar espectros que se aplican en la investigación y el sondeo hidrográficos, es decir, fuera del entorno "limpio" de un laboratorio óptico. Aquí no se requiere la alta resolución espectral de los espectrómetros láser, que hace que estos instrumentos sean muy útiles para muchos propósitos.
Cada muestra de sustancia se analiza con los parámetros de longitud de onda que se indican en la siguiente tabla. Las longitudes de onda de excitación se seleccionan de acuerdo con las líneas de emisión de lámparas espectroscópicas o láseres que se aplican de manera prominente para tales fines. La emisión se registra con un incremento de longitud de onda de un nanómetro.
La orientación geométrica de la cubeta de muestra con respecto a la trayectoria de los rayos de excitación y emisión, difiere de la configuración convencional de 90 grados. Debido a la alta absorbancia de las muestras, la cubeta está orientada de tal manera que la fluorescencia se estimula y registra a través de un sólo lado de la cubeta, con un soporte de cubeta denominado ensamblaje de superficie frontal por algunos fabricantes. Este método permite un análisis directo de líquidos de alta absorción, evitando la dilución de muestras con disolventes orgánicos que podrían contribuir por sí mismos a la señal de fluorescencia.
En esta configuración, sin embargo, se debe prestar especial atención a la calidad de la cubeta en sí: se requiere la mejor sílice fundida disponible, de lo contrario, las contribuciones de fluorescencia de la ventana de la cubeta oscurecen la fluorescencia de la muestra. Por la misma razón, las cubetas deben limpiarse con mucho cuidado después de cada llenado con muestras altamente fluorescentes.
Parámetros Básicos de las Medidas de Fluorescencia
Las longitudes de onda se expresan en nanómetros.
| Longitud de onda de estimulación | Ancho de banda de estimulación | Rango de emisión | Ancho de banda de emisión |
|---|---|---|---|
| 253 | 5 | 260-699 | 3 |
| 308 | 5 | 320-699 | 3 |
| 337 | 5 | 340-699 | 3 |
| 365 | 5 | 370-699 | 3 |
Un requisito fundamental para medir espectros de forma fiable es realizar una calibración cuidadosa del instrumento tanto en el lado de excitación como en el de emisión de la configuración óptica. El procedimiento de calibración para un espectrofluorómetro Perkin Elmer, como se describe en detalle a continuación, nos permite derivar datos que se corrigen para la sensibilidad espectral del instrumento y permite que las señales que se originan en diferentes sustancias se relacionen entre sí en una escala relativa. En principio, todos los espectrofluorómetros disponibles comercialmente se pueden calibrar de esta manera o de una forma similar, y es obligatorio seguir este procedimiento para que los datos espectrales se incluyan en este catálogo.
La calibración absoluta de espectros en unidades de sección transversal como, por ejemplo, cm2/sr se ve obstaculizada por una aparente falta de sustancias de referencia estándar que sean aplicables para este propósito. Por lo tanto, una de las muestras de petróleo investigadas aquí, el Petróleo Crudo Ligero de Nigeria, se utiliza como material de referencia. Su emisión de fluorescencia, integrada de 320 a 699 nm y excitada con una longitud de onda de 308 nm, se establece arbitrariamente para que tenga una eficiencia de uno. Los espectros de otras sustancias, y también obtenidos con otras longitudes de onda de excitación, se dan en relación a esta unidad. Para permitir al usuario interpretar cuantitativamente estos espectros y garantizar la compatibilidad de los datos obtenidos por diferentes laboratorios en el futuro, se puede poner a disposición una muestra de crudo ligero nigeriano a pedido.
Un ejemplo: Medición con el Espectrofluorómetro Perkin Elmer modelo 650-40
El ensamblaje de superficie frontal, equipado con cubetas de sílice estándar de 1 cm, fue aplicado con estas muestras altamente absorbentes. El instrumento se ejecutó con los parámetros enumerados en la tabla anterior y con un impulso de longitud de onda de 60 nm/min y un tiempo de integración de 1 segundo. Todas las mediciones se realizaron a temperatura ambiente (20°C). El instrumento está equipado con una lámpara de CC de xenón como fuente de luz. El espectro de emisión y la estabilidad de la lámpara, y la trayectoria del rayo de excitación se controlan diariamente antes y después de cada serie de mediciones. Esto se realiza mediante una pantalla de fluorescencia de 0,02 mol/L de 1-dimetilamino naftaleno 5-sulfonato en una solución de NaOH en agua. La solución es prácticamente opaca a longitudes de onda por debajo de 350 nm y sólo absorbe ligeramente por encima de 450 nm. Por lo tanto, se deduce que con un ajuste constante a 500 nm del monocromador de detección y la exploración del monocromador de excitación entre 250 y 450 nm, la emisión de esta muestra produce una medida directa de la intensidad espectral de la ruta de excitación en este rango de longitud de onda. Dado que la solución es muy absorbente, se requiere el ensamblaje de superficie frontal.
El mismo resultado también se puede obtener con el colorante orgánico Rodamina B cuya banda de fluorescencia presenta un pico a 600 nm. Este material permite una extensión de la curva de calibración hasta la porción roja del espectro. Para ello, se utiliza una solución concentrada de rodamina B (3 mg/L en etilenglicol). El monocromador de excitación se escanea de 200 a 600 nm, mientras que el monocromador de emisión se establece en 615 nm.
La estabilidad del sistema de detección se controla diariamente, utilizando una solución de 1 ppm de sulfato de quinina dihidrato en 0.1 mol/L HClO4 como patrón de fluorescencia ( Velapoldi & Mielenz, 1980). De esta forma, la estabilidad a largo plazo de la configuración del detector es mejor que el 2% durante un período de 1 mes.
La emisión de fluorescencia del sulfato de quinina cubre un rango de longitud de onda de 400 a 550 nm (~10% de puntos de intensidad de la intensidad máxima a 450 nm) y, por lo tanto, se puede utilizar como material de calibración en esta región del espectro. Con el fin de calibrar la trayectoria de emisión del instrumento en longitudes de onda por debajo y por encima de este rango, se deben aplicar otros medios. Una calibración de banda ancha se realiza preferiblemente con una lámpara estándar de tungsteno con una temperatura luminosa conocida. En estas mediciones, una lámpara estándar OSRAM WI 9 con TB = 2856 K. Un tubo negro en la trayectoria del rayo entre la lámpara y el detector frente a su apertura de entrada sirve para eliminar posibles contribuciones de luz parásita de la señal. El eje óptico de la trayectoria de detección de rayos se controla con el rayo de salida de un láser HeNe. La posición del estándar de tungsteno está a una distancia de 5 m del espectrofluorómetro. Con la lámpara OSRAM WI 9 utilizada aquí, se puede lograr una calibración de hasta 350 nm de longitud de onda. Se puede hacer una extensión adicional hasta los rayos UV con una lámpara halógena de tungsteno debido a su temperatura de filamento más alta y la bombilla de cuarzo. El espectro de emisión de esta lámpara, si no está calibrado, se determina comparándolo con el estándar de tungsteno calibrado. Las temperaturas luminosas de 3200 K generalmente permiten su uso como fuente de calibración hasta 300 nm o incluso longitudes de onda más bajas.
